Зубы из пробирки (Test-Tube Teeth).

Зуб человека устроен гораздо сложнее, чем может показаться на первый взгляд. Если специалисты в области тканевой инженерии сумеют сконструировать полноценные зубы для замены утраченных, то в дальнейшем удастся добиться успехов и в регенерации более крупных органов.

ОБЗОР: НА ПЕРЕДНЕМ КРАЕ ЗУБНОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Работая над созданием полноценных зубов, способных заменить утраченные, некоторые специалисты по тканевой инженерии имитируют процессы, происходящие на эмбриональном уровне. Альтернативный подход состоит в создании зубов из уже существующих клеток зубной ткани или выращивании таких клеток из тканей-предшественников. Оба метода уже дали результат: с их помощью получены правильные в структурном отношении зубы. Нерешенными остаются проблемы образования корней и идентификации идеального исходного материала для биоконструирования зубов человека. Однако прогресс в данной области столь стремителен, что, возможно, полноценый зуб станет первым органом, выращенным в пробирке.

ОБ АВТОРАХ:

Пол Шарп (Paul T. Sharpe) и Конан Янг (Conan S. Young) впервые встретились два года назад на конференции по биоинженерии зубов и костей. Шарп, профессор Королевского колледжа (Лондон), возглавляет отдел по изучению развития лицевой части головы в госпитале Гая в Лондоне. В 2002 г. он создал биотехнологическую компанию Odontis Ltd, основным направлением работы которой стало выращивание зубов и костей человека путем воспроизведения процессов их формирования у эмбриона. Янг преподает в Гарвардской стоматологической школе и является штатным научным сотрудником Института Форсайта в Бостоне. Он занимается конструированием зубов с использованием биодеградируемых каркасов.

Те или иные проблемы с зубами возникают в течение жизни у 85% взрослых европейцев. К 17 годам 7% людей теряют один-два зуба, а после 50 лет мы лишаемся в среднем 12 зубов. Идеальной заменой выпавшего зуба был бы новый, выращенный в том же месте из ткани самого пациента. Однако долгие годы о решении такой биоинженерной задачи оставалось только мечтать. Ситуация изменилась лишь недавно, благодаря детальному изучению начальных этапов формирования зубов и успехам в области биологии стволовых клеток и тканевой инженерии. Помимо тех благ, которые сулит больным новый метод, его дальнейшая разработка позволит решить и общие проблемы замены вышедших из строя органов. Зубы представляются очень удобным «испытательным полигоном»: они не относятся к числу жизненно важных органов, а потому неудача не грозит катастрофическими последствиями. Звучит, возможно, не очень гуманно, но опыты на зубах могут проложить дорогу к разработке аналогичных операций на тех органах, где врачебная ошибка недопустима.

Все вышесказанное не означает, что «зубная» инженерия – дело простое. Сложившийся за миллионы лет эволюции механизм формирования любых органов начинается еще на эмбриональном уровне. Задача специалистов в области тканевой инженерии – воспроизвести все этапы процесса с их изощренной системой контроля. И прежде чем приступить к ее решению, целесообразно разобраться в том, что задумала сама природа.

Тайные переговоры

Шестинедельный человеческий эмбрион не превышает в длину 2,5 см, формы будущего тела едва заметны. Однако его клетки непрерывно обмениваются информацией, в том числе и относительно формирования зубов. Процесс передачи сигналов крайне сложен, поэтому органы нельзя вырастить от начала и до конца in vitro. Ученым вряд ли удастся когда-нибудь полностью воспроизвести условия естественного образования тканей. Но чем больше они узнают о самых ранних этапах их развития, тем скорее сумеют создать «ростки» зубов, имплантировать их в организм и предоставить природе возможность довершить остальное. Зарождение зубов происходит в результате взаимодействия между двумя разными типами эмбриональных клеток: эпителиальных и мезенхимных. На первых стадиях существования зародыша эпителиальные клетки ротовой полости (из них образуется ее выстилка) посылают первые сигналы клеткам мезенхимы (они строят костную структуру челюсти и мягкие ткани) к началу одонтогенеза (формирования зубов). Последние сообщают эпителиальным клеткам, что «задача ясна», далее начинается своеобразный диалог между участниками процесса «возведения» зубов.

Вначале будущий зуб представляет собой не более чем утолщение эпителия ротовой полости эмбриона. Из него в глубь подлежащей мезенхимы врастает эпителиальный пласт, вокруг которого, в свою очередь, происходит уплотнение мезенхимы. В результате к седьмой неделе у эмбриона образуется зубной зачаток. Прорастая все глубже, он принимает форму перевернутой чаши. Эта структура образует так называемый эмалевый орган, в полость которого снизу начинает врастать мезенхима. В дальнейшем из ее клеток формируются внутренние части зуба: дентин, пульпа, цемент, периодонтальная связка, удерживающая зуб в костной ткани челюсти. Из эпителиальных клеток образуется наружная часть, которая прорезывается из десны на 6–8-й месяц после рождения ребенка.

Форма будущего зуба определяется его местоположением. Некоторые посылаемые эпителиальными клетками сигналы, которые запускают процесс одонтогенеза, участвуют в регуляции работы важной категории генов мезенхимы. Все они содержат специфическую нуклеотидную последовательность (так называемый гомеобокс) и способствуют развитию различных органов. При формировании челюсти в определенных ее участках активизируются разные гомеобокс-гены, предопределяющие закладку и формирование моляров, премоляров, клыков и резцов.

Так, гомеобокс-ген Barx1 экспрессируется в тех клетках мезенхимы, где в будущем появятся моляры. В ходе опытов на животных ученые вынудили этот ген проявиться там, где должен был быть резец.

Зуб – настоящее чудо дизайнерского искусства, сотворенное природой. У человека на его формирование уходит минимум 14 месяцев. В закладке зубов у эмбриона участвуют ткани двух типов; между их клетками происходит непрекращающийся диалог. Специалисты по тканевой инженерии тщательно исследуют этот поток информации, чтобы использовать полученные данные при создании функциональных искусственных зубов.

ОБРАЗОВАНИЕ ЗУБОВ

Первые намеки на зубы у эмбриона человека появляются на 6–7-й неделе после зачатия, когда начинает угадываться форма головы. На месте образования будущего зуба происходит небольшое уплотнение эпителиальной ткани ротовой полости, и эпителиальные клетки начинают посылать сигналы клеткам подлежащей мезенхимы. По мере прорастания эпителия в ткань мезенхимы клетки последней посылают ответные сигналы и концентрируются вокруг эпителиального выроста, образуя зачаток зуба. К 9-й неделе слой эпителиальной ткани образует структуру в форме перевернутой чаши, которую заполняет мезенхима. В центре чаши появляется эмалевый «узелок», который теперь служит основным «командным пунктом», откуда отдаются приказы клеткам эпителия и мезенхимы. К 14-й неделе формируется «колокол», состоящий из слоя дифференцирующихся клеток, называемых амелобластами (из них позже образуется эмаль) и слоя одонтобластов (прародителей дентина). Последними появляются корни, формирование которых завершается к моменту прорезывания зубов (6–12 мес. после рождения).

Однако вместо него сформировался моляр. Способность контролировать и предопределять форму зуба крайне важна для зубной инженерии, и ключевую роль здесь играет регуляция активности таких генов, как Barx1. Кроме того, каждый сигнал должен поступать клеткам развивающегося зуба в определенное время.

Первые эксперименты по воспроизведению зубов животных были проведены в Англии в начале 1960-х гг. В последующие тридцать лет ученые пытались вырастить зуб, соединив вместе крошечные кусочки эпителиальной ткани и мезенхимы из области зубного зачатка, взятого у эмбрионов мышей. Такую конструкцию помещали в культурную среду или имплантировали в ту область тела животного, которая хорошо снабжалась кровью. Оказалось, что эмбриональные зубные зачатки до поры до времени развивались нормально, однако образования дентина и эмали не происходило, и дальше процесс не шел.

Для завершения формирования зубов необходимы определенные факторы роста и сигналы, поступающие эмбриону от клеток челюсти. Казалось бы, в таком случае нужно просто трансплантировать зубной зачаток в челюсть – и из него разовьется нормальный зуб. Однако ткань челюсти взрослого человека существенно отличается от эмбриональной, и нет никакой уверенности, что посылаемые ею сигналы будут адекватными.

В ходе исследований зубы поросят измельчили в порошок и обработали ферментами. Полученные изолированные клетки поместили в биодеградируемый каркас. После недельной инкубации по периметру формы образовалось скопление клеток – синяя полоска (рисунок вверху слева). В последующие 25 недель (рисунок вверху справа) каркас растворился, зато появились пульпа, эмаль и дентин. Результатом таких экспериментов стало образование крошечных структур, похожих на зубы. Однако правильная организация тканей новообразования (внизу слева) отмечалась лишь в 15–20% случаев. Чаще «зуб» не имел упорядоченной структуры (внизу справа). Тем не менее подобные эксперименты свидетельствуют о способности изолированных клеток зубов к самоорганизации и образованию островков тканей зуба.

Кроме того, важно, чтобы искусственный зачаток имел правильное соотношение разных клеток, иначе в нем не образуются нужные вещества и структуры. Лучше всего было бы использовать в качестве исходного материала ткани самого пациента (в этом случае они не воспринимаются организмом как чужеродные и не вызывают отторжения). Итак, чтобы добиться успеха в зубной инженерии, нужно выполнить три условия. Во-первых, использовать клетки самого пациента, во-вторых, добиться того, чтобы будущий зуб правильно развивался в окружении ткани челюсти взрослого организма, образуя корни, прочно фиксирующие его на месте с помощью периодонтальной связки. И в-третьих, чтобы форма и размер новой структуры были такими же, как у настоящей.

Разрушить, чтобы воссоздать

В конце 1980-х гг. специалист по трансплантации органов Джозеф Ваканти ( Joseph P. Vacant i) из Гарвардской медицинской школы и химик-полимерщик Роберт Лангер (Robe r t S . L ange r) из Массачусетского технологического института провели следующий эксперимент. Они поместили клетки определенной части тела в заранее изготовленную биодеградируемую форму, намереваясь вырастить в ней орган для трансплантации. Ученые опирались на тот факт, что клетки, формирующие ткани живого организма, постоянно обмениваются сигналами и часто перемещаются с места на место в пределах некой образуемой ими трехмерной структуры. Каждая клетка заранее «знает» свое место и роль в будущем организме. Следовательно, если поместить правильно подобранный набор отдельных клеток, полученный путем дезинтеграции ткани, в каркас подходящей формы, то они самоорганизуются и воссоздадут искомый орган.

Первые успешные эксперименты по регенерации кусочков ткани печени из отдельных клеток, проведенные Ваканти и Лангером, послужили стимулом к разработке аналогичных методик для получения других сложных органов – сердечной мышцы, костной ткани и зубов. В 2000 г. Памела Йелик (Pamela C. Yelick) и Джон Бартлет ( John D. Bartlet) из Института Форсайта в Бостоне попытались вместе с Ваканти реконструировать зубы свиньи. (У этих животных, как и у человека, закладываются два набора зубов – молочные и постоянные).

В работе принимал участие и один из авторов статьи (Янг). В качестве исходного материала были взяты непрорезавшиеся третьи моляры шестимесячных поросят. Чтобы получить однородную смесь клеток зубной эмали (происходящих из эпителия) и пульпы (происходящих из мезенхимы), зубы раздробили как можно мельче и затем обработали ферментами. Каркас в форме зуба изготовили из биодеградируемого полиэфирного материала и покрыли веществом с хорошими адгезивными свойствами, чтобы клетки легко на нем адсорбировались. Затем в емкость поместили набор клеток и имплантировали его в сальник крысы (хорошо снабжаемую кровью жировую ткань, окружающую кишечник). Выбор места трансплантации крайне важен, поскольку развивающиеся зубы должны иметь необходимые питательные вещества и кислород.

Спустя какое-то время после операции каркас рассосался, вместо него образовалась новая ткань, а через 20–30 недель появилась структура, сходная по форме и составу с настоящим зубом (причем развились все основные его компоненты: эмаль, дентин, пульпа и зачатки корней). Казалось очевидным, что «зубы» сформировались в организме крысы в результате самоорганизации соответствующих клеток внутри каркаса. Но чтобы исключить элемент случайности, было решено провести еще один эксперимент. Группа ученых из Института Форсайта использовала гомогенат зубной ткани – эпителиальные и мезенхимные клетки, полученные из первых и вторых зубов, а также моляров крыс. На этот раз их культивировали в течение шести суток, и только затем перенесли в каркас и имплантировали. По прошествии 12 недель сформировавшиеся структуры изъяли и тщательно исследовали. И вновь обнаружилось, что внутри формы образовалось нечто вроде зубов с эмалью, дентином и пульпой. Полученные результаты подтвердили предположение о самоорганизации клеток при формировании зубов. Кроме того, они показали, что предварительное культивирование не оказывает отрицательного воздействия на процесс, что очень важно для конструирования зубов человека, предполагающего использование клеток самого пациента. И, наконец, была продемонстрирована возможность регенерации зубов еще одного млекопитающего.

Ученые из Института Форсайта научились воссоздавать большинство типов тканей зуба, используя в качестве исходного материала соответствующие клетки взрослого организма. Однако, будучи предоставлены самим себе, они структурировались правильно только на 15–20%. Поэтому ученые продолжают работать над созданием прецизионных методов размещения различных типов клеток в матрице, с тем чтобы получать полноценные зубы.

В то же время исследователи не исключают возможного участия в формировании зуба стволовых клеток, которые, возможно, содержатся в зачатках третьего моляра, клетки которого используются для образования новой ткани. Если ученые докажут этот факт, то процесс воссоздания челюсти с использованием матрицы значительно ускорится.

С нуля

Шарп и его коллеги из Королевского колледжа в Лондоне пытаются воспроизвести в лабораторных условиях естественный рост зуба с эмбрионального уровня. Для этого необходимо выяснить принципы регуляции первых этапов формирования зубов и найти источник клеток, образующих эпителий и мезенхиму ротовой полости зародыша. Исходным материалом для исследований служат клетки (как стволовые, так и обычные) эмбрионов мышей и взрослых особей. С их помощью исследователи намереваются выяснить роль клеток разного типа в процессе формирования зубов от начала до конца. Как правило, клетки мезенхимы подвергают центрифугированию, пока они не образуют плотный осадок. Последний покрывают слоем эпителиальных клеток и в течение нескольких суток культивируют такой «бутерброд», отслеживая активность различных генов, чтобы уловить первые признаки образования зубов. Затем зачатки имплантируют в хорошо снабжаемый кровью орган взрослого животного (например, в почки) и наблюдают за процессом на протяжении 25 суток.

В таких условиях происходит формирование зубов, однако только в том случае, если эпителиальные клетки взяты от эмбриона, а среди клеток мезенхимы имеется хотя бы небольшое количество стволовых. Когда вместо клеток мезенхимы были взяты стволовые клетки костного мозга взрослого животного, из трансплантированного материала также сформировался правильный в структурном отношении зуб. Следовательно, при конструировании зубов эмбриональные клетки мезенхимы можно заменить стволовыми клетками взрослого организма.

С заменой эпителиальных клеток эмбриона дело обстоит сложнее. Дело в том, что они содержат уникальный набор необходимых для одонтогенеза сигнальных молекул, которые после рождения исчезают из тканей полости рта. Шарп и его сотрудники пытаются найти во взрослом организме эффективные заменители. Они уже получили обнадеживающие результаты, используя комбинацию стволовых клеток взрослых животных и эпителиальные клетки полости рта эмбриона. Очень важно, что образующиеся таким образом зубы имеют нормальный для мышей размер, они окружены костной и соединительной тканями и проявляют первые признаки образования корней. Теперь нужно попробовать получить такие же результаты in vivo, т.е. вырастить зубы там, где им положено быть. У эмбриона челюсти, мягкие ткани, костное вещество и сами зубы развиваются одновременно, не подвергаясь никаким аномальным внешним воздействиям. Однако рот взрослого животного представляет собой уже сформировавшуюся конструкцию, и неизвестно, будут ли в таких условиях поступать сигналы, необходимые для развития имплантанта.

Чтобы прояснить все сомнительные моменты, Шарп изъял зачатки зубов у эмбриона мыши и трансплантировал их в мягкую ткань верхней челюсти взрослого животного между молярами и резцами, где зубы, о идее, не растут. Трансплантант зафиксировали в небольшом надрезе с помощью хирургического клея. После операции мышам давали только мягкую пищу. Через три недели в диастеме прорезались зубы. Они росли в правильном направлении, имели надлежащий размер и прикреплялись к кости с помощью мягкой соединительной ткани (рис.).

 
новый зуб, служит результат трансплантации. На срезе области диастемы в верхней челюсти животного виден зуб, выступающий из десны (второй зуб, расположенный на рисунке выше и правее первого, только формируется). Видна пульпа прорезавшегося зуба. Красным окрашены твердые ткани, эмаль и дентин. Корней у зуба нет, он фиксируется в челюсти с помощью мягкой соединительной ткани.

Таким образом, условия, в которые попадает зачаток зуба при трансплантации в ткань взрослого животного, вполне приемлемы для его нормального развития. Однако на пути к искусственному выращи- ванию человеческого зуба нас, несомненно, ждет еще не один крутой поворот.

Перспективы

Для успешного конструирования зубов требуется гораздо меньше времени, чем для воссоздания других органов. Разработка простых методов отслеживания процесса остается пока проблемой. Другая задача – предсказание и контроль формы и размера зубов – близка к решению. Зачатки моляров и резцов, выращенные в культуре, легко различимы как по внешнему виду, так и по активности их генов, чего нельзя сказать о премолярах и клыках.

Зубы, формирующиеся у взрослых мышей из трансплантированных зачатков зубов эмбрионов, соответствовали по форме тем, которые должны были вырасти у них на том же месте. Это свидетельствует о том, что информация о форме будущего зуба уже заложена в нем изначально. Специалистам по тканевой инженерии нужно в деталях разобраться в природе формообразующих сигналов, чтобы использовать их при конструировании зубов человека.

Несмотря на успехи исследователей, все зубы, выращенные в лабораторных условиях, не имели полноценных корней (они образуются в последнюю очередь, уже в ходе прорезывания зубов). Остается еще один неясный момент – сколько времени понадобится на то, чтобы у человека вырос полноценный зуб из имплантанта. Известно, что не только молочный, но и второй набор зубов тоже закладывается в период эмбрионального развития, они прорезываются на 6–7-м году жизни, а зубы «мудрости» – на 20-м. Опыты с регенерацией зубов у животных свидетельствуют, что все происходит гораздо быстрее, однако неизвестно, когда процесс завершается, и эмаль полностью затвердевает.

Серьезной задачей представляется также поиск легкодоступного источника клеток пациента, которые стали бы приемлемым исходным материалом для будущего зуба. Нужно, чтобы имплантант не вызывал иммунного ответа, кроме того,протезы должны обладать теми же характеристиками. Шарп и его сотрудники обнаружили, что вместо эмбриональных клеток мезенхимы могут быть использованы и соответствующие стволовые клетки из костного мозга взрослого организма. Заменитель эмбриональных эпителиальных клеток пока не идентифицирован. Обнадеживает то, что стволовые клетки обнаружены и в других тканях взрослого организма, которые имеют эпителиальное происхождение (например, в коже и волосах). Вероятно, их можно будет генетически видоизменить так, чтобы они индуцировали сигналы к одонтогенезу.

Наиболее подходящим источником необходимых клеток являются сами зубы. Возможно, в них содержатся стволовые клетки, способные давать начало разнообразным тканям зуба, в том числе и эмали. Об этом свидетельствуют и такие факты: при повреждении зуба происходит естественная частичная регенерация дентина и других тканей. Так что можно предположить, что когда-нибудь новые зубы будут делать путем перекраивания старых.